當回轉驗證后呈陽性結果，需要GST-PULL DOWN（非生理條件下的驗證，僅是體外驗證，）；

如果想進一步確定結果，可以做CO-IP,（生理條件下的驗證，結果比較可靠）；

IP與CO-IP的關系：

IP就是用抗體把你要的蛋白免疫沉淀下來，然后去檢測它。例如蛋白A在細胞內的蛋白量不同，或者有著不同的翻譯后修飾，這是可以用A蛋白的抗體+prorein A beads來IP，從細胞中把A拉下,再用特異的抗體（如磷酸化，泛素化抗體）來檢測A的變化。

co-ip的原理和IP是一樣的，但是它檢測的是和A相互作用的蛋白，也就是說用A的抗體把A拉下來后，用和A相互作用蛋白B的抗體去檢測，來證明A和B之間的相互作用。 就是說只要用A的抗體把B拉下來就能證明A和B之間有相互作用。

這種關系只能說是存在相互作用，但這種相互作用并不能確定是直接的還是間接的，也就是所也許是A與c作用，而B也和C作用，這樣，用A的抗體可以把C拉下來，但同時C又把B也拉下來了。要確定A和B之間直接的相互作用，你可以做體外的GST PULL DOWN實驗。

GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗技術,近年來越來越受到廣大學者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白",目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白"(目的蛋白),洗脫結合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,“誘餌蛋白"和“捕獲蛋白"均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。（GST：谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase)）

GST pull down 和 Coim munoprecipitation關系問題

啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 學過生物的地球人都知道. 這是研究蛋白質相互作用的兩種方法.

簡單通俗的打個比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤島上, 除非蜂馬牛不相及, 同類男女之間該發(fā)生的一般都會發(fā)生. 這種關系是直接的.

Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 則是, 眾里尋他千百du, 那人卻在燈火闌珊處. 研究一群男女間的自由戀愛問題. 一個蛋白在本性上可以同時喜歡很多其他的蛋白, 但是最終還是會有個最喜歡的, 而在Co-ip中就能發(fā)現(xiàn)他的喜好. 這種關系可能是直接的, 也可能是間接的, 是更接近于東方的.

兩個蛋白可能在生物體內素昧平生, 一個在頭上, 一個在腳上. 也許兩者之間或許很合轍, 生來卻天各一方. 在GST pull down 的環(huán)境中, 他們可能相遇, 吸引在一起. 但在現(xiàn)實生活中, 這樣的浪漫關系可能是不現(xiàn)實的. 腳上的蛋白若是跑到頭上與情人幽會, 人就要出大問題. 還有的情況是, 兩個蛋白即使獨處在一起, 也可能不會互相吸引, 但是到了生物系統(tǒng)的大環(huán)境中, 在其他蛋白, 各種因素適當?shù)妮o助下, 卻有可能形成穩(wěn)定的搭檔關系。

免疫共沉淀實驗由于在非變性實驗條件性進行，這樣蛋白質之間的天然相互作用得以zui大程度的保留，因此可以比較真實的反應蛋白質之間的相互作用。但也基于此點，免疫共沉淀并不能顯示蛋白質之間的相互作用是直接還是間接的，因為通過目的蛋白抗體共沉淀下來的是一個蛋白復合物，而不僅僅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull down實驗可以通過體外實驗條件，去除其它蛋白的影響，從而確定目的蛋白和待檢測蛋白是否可以發(fā)生直接相互作用。

做蛋白質相互作用的三個經(jīng)典方法，也可以說是逐步嚴謹?shù)姆椒ā?/p>

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)

凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA, electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測 如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據(jù)目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNApian段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復合物的特點和強度來確定特異結合。

GST親和層析和GST Pull-down方法

此方法的基本原理是：利用重組技術將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離。在病毒受體研究中，融合蛋白通常設計為病毒吸附蛋白（VAP）。這方面成功的例子有HBV。具體做法如下：將GST-融合探針蛋白 （VAP）和GTH-Sepharose制成親和層析柱，然后待分析的蛋白質混合液流經(jīng)親和層析柱，梯度洗脫， 分離、收集各蛋白組分，這稱為GST親和柱層析（GST affinity column chromatography）。

如果一開始待檢蛋白就和GST- 融合探針蛋白與 GTH-Sepharose一起共同孵育，經(jīng)離心收集洗脫復合物和洗滌后，再加入過量GTH獲得相互作用蛋白的復合物，那么這種方法則稱為GST pull down。

GST親和層析及相應的GST Pull-down方法的優(yōu)點是敏感，對混合物中的所有蛋白均“一視同仁"，也可用于受體功能的鑒定。缺點是GST有可能影響融合蛋白的空間結構，另外，蛋白質濃度對實驗也有一定影響。